小鼠8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA试剂盒说明书

小鼠8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA试剂盒仅供体外研究使用                                    

预期应用
ELISA法定量测定小鼠组织匀浆、血清、血浆、细胞培养上清、尿液或其它相关生物液体中8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）含量。

 
概述
DNA链上的碱基鸟嘌呤C-8位易受到羟自由基及单线态氧的攻击而发生羟化，生成加合物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）。8-OHdG是DNA氧化损伤的特异产物，是*的内源性及外源性因素对DNA氧化损伤的生物标志物。8-OHdG是DNA氧化损伤的主要产物之一。在复制过程中，DNA链上8-OHdG可以与C以外的其它碱基配对形成点突变，其中GC→TA突变的发生已为大量研究所证实，并被认为是氧化应激因素致癌、致突变的主要机理之一。机体修复机制正常时，8-OHdG可以在hOGG1等酶的作用下从DNA链上切除并重新掺入正常的鸟嘌呤碱基，而切下的8-OHdG则可入血经尿液排出体外。8-OHdG在体内稳定存在，一旦形成不再被机体进一步代谢，尿中8-OHdG含量与细胞内DNA氧化损伤程度相关。目前机体8-OHdG水平已被广泛接受为评价DNA氧化损伤的标志物，并用来估计氧化应激相关癌症发生的危险性。

 
实验原理
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗8-OHdG抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗8-OHdG抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的。颜色的深浅和样品中的8-OHdG呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

 
试剂盒组成及试剂配制
1.         酶联板：一块（96孔）

2.         标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为5,000 pg/ml，做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释）后，分别稀释5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。

如配制2,500 pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）5,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3.         样品稀释液：1×20ml/瓶。

4.         检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5.         检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6.         检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul检测溶液A加990ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7.         检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.   浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.  终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

11.  覆膜：1×5张
 
标本的采集及保存

1.         血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.         血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.         细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

4.         组织匀浆：将动物的组织标本先用PBS洗涤，去除多余血液，匀浆化后放在20ml PBS中于-20℃放置过夜，第二天，经过二次反复冻融破膜，将匀浆物5000x g离心5分钟，取上清即可检测。

5.  样本处理：血清或血浆标本推荐稀释10倍，如：稀释10倍，取10ul血清或血浆加入90ul样品稀释液。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立*稀释倍数。

注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过3个月，-80℃不应超过6个月；标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测；高血脂的标本不需进行特殊处理，可直接检测。
 
操作步骤
实验开始前，请提前配制好所有试剂；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，均应用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。建议各实验室在操作前先进行预实验以建立*稀释倍数。

1.         加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.         弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul（在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

3.         温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.         每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液） 100ul，37℃，60分钟。

5.         温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.         依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色立转。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后立即进行检测。

 
注：

1.         每次实验留一孔作为空白调零孔（不同于空白孔），该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2.         严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。

3.         洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入检测溶液B或底物前确保尽量吸干孔内液体。为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板长时间处于干燥状态。

4.         消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

5.在储存和温育时避免强光直接照射。

6.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，请配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10ul），以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；检测液A、B，以及底物溶液在使用前，应置于37℃温育30分钟；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

7.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

 
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水

纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需

要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

 
特异性
    本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG），且与其它相关蛋白无交叉反应。

 
计算
  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线（推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3），根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

 
注意事项
1.         洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2.         一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。

3.         请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。

4.         如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

5.         在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6.         底物请避光保存。

 
检测范围：78 pg/ml - 5,000 pg/ml

 
zui低检测限：39 pg/ml

 
ELISA试剂盒