小鼠ELISA试剂盒实验操纵规则

       小鼠ELISA试剂盒法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，以为小鼠ELISA试剂盒法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操纵等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。

可概括四个方面： 

1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 

2、研究抗酶抗体的合成。

 3、显现微量的免疫沉淀反应。

 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。越日，弃往孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 

2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空缺孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 

3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加进新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 

4.　加底物液显色：于各反应孔中加进临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 

5.　终止反应：于各反应孔中加进2M硫酸0.05ml。 

6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+"、“-"号表示。也可测O·D值：在小鼠ELISA试剂盒检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空缺对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

基本方法二　用于检测未知抗体的间接法： 

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。越日洗涤3次。 

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加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空缺、阴性及阳性孔对照) 

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于反应孔中，加进新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,后一遍用DDW洗涤。 

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其余步骤同“双抗体夹心法"的4、5、6。

（二） 酶与底物

       酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是 小鼠ELISA试剂盒成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。