细胞分析技术 天地无限广阔

细胞是具有生命的zui小生物体单位，它可以方便地提供一个窗口，供科学家对生命体内外的过程作更广泛的研究。基于细胞的分析技术（CBAs）已经给药物筛选带来了希望。在克隆技术出现之前，科学家主要是通过试验化合物的生理或病理生理效应来发现新的药物，而分子生物学和重组体DNA方法则允许针对特定的靶分子进行筛选，这在当时成为了一大突破。CBAs的出现，使药物的发掘又有了新的努力方向，药物研发也展现出了新的振兴曙光。

　　Threshoer制药公司的CharlesHart博士认为，靶标确认的挑战，以及通过多标记对多种药物进行筛选的鉴定，使人们转向了以细胞表型为基础的筛选分析技术。例如，今天筛选新骨质疏松症治疗药剂的过程，就是直接对破骨细胞、成骨细胞或两者的试验来进行，而不再分析离析出的雌激素、降钙素或甲状旁腺素受体。

　　Threshoer制药公司使用CBAs筛选候选药物并且探查药物的药理学机理。公司的一个癌症药物研究项目利用了低氧细胞模拟癌症复发过程。另一个项目则是研究良性细胞的繁殖（如良性前列腺增生肥大）。在相应分析过程中，研究人员通常要选用几种不同类型的细胞去模拟生物组织的结构和行为。

　　Hart博士利用荧光标记、荧光读数计和细胞计数器作为技术手段，研究代谢活性、分子生物标记、细胞活力，细胞程序性死亡以及细胞周期。

　　CBAs为那些利用多参数分析系统研究复杂体系的药物公司带来了巨大的经济效益，分析系统采用的是多重荧光探针。微体积细胞计量术和FACS（荧光激活细胞分选技术）相结合，可以对群体内的单个细胞进行表征。自动显微镜检查法、图像分析、高通量筛选是多参数技术的其他应用实例。Threshoer制药公司对FRET（荧光共振能量转移）的新型应用领域也很感兴趣，因为它允许对蛋白质—蛋白质的相互作用过程进行空间分辨和鉴定。

　　“这些技术使我们能够研究生物化学、细胞生物学、生物学等诸学科间的边缘领域的有关课题，”Harf博士指出，“大分子复合体就属此类，如复制体、转录体、炎性体（inflammasome）和氧化还原体。此水平的生物学确实是新领域之一，而基于细胞水平的多参数荧光分析则是深入理解这些内容的一个主要途径。”

　　荧光：伟大的标记能手

　　“荧光标记技术和先进的检测方法大大推进了CBAs的发展，”Guava技术公司试剂产品主任LawrenceLem博士说，“荧光所提供的灵敏度是比色测定所*的。”毋庸讳言，放射标记法也极为灵敏。但是由于涉及到工作人员的安全问题，以及药品处理和执照（现在购取放射性材料已变得更加困难）等问题，而使放谢性同位素法丧失了魅力。

　　可以预言，人们对混合细胞分析的兴趣必然会日益浓烈，因为它可以对生物组织、整个有机体或其他复杂体系提供合理近似结果，而同是又避开了饲养动物的麻烦。混合细胞分析是将两个或更多个器官的细胞混合起来，同时监测一个实验条件对所有细胞的影响。例如，可以利用B细胞和T细胞混合体进行免疫-调节药物的实验分析，一个癌症化合物可以在正常的、癌性的和血管祖细胞中进行试验。

　　细胞计量术是混合细胞分析的手段之一。流式细胞计量术每秒钟可分析数千个细胞，并可拣出稀有细胞。它可以取代消耗劳力较大的微量滴定分析方法。微量滴定法需要先进行溶解和添加试剂，随后再进行ELISA或Western印迹分析，手续烦琐。流式细胞计量术操作简单，但目前不幸的是，由于流式细胞计量仪结构复杂、价格昂贵，致使许多研究人员暂时还没有机会采用这种技术。Guava声称要让这类仪器更小型化，更简单，方便易用，从而攻克阻碍研究人员使用流式细胞计量仪的壁垒。

　　通过细胞分析，科学家可以阐明分泌蛋白质的产生、信号转导和细胞分裂等基础生物学问题。BeckmanCoulter细胞分析业务BrendanYee认为，在利用荧光方面检测方法的改进是近5年来CBAs中zui主要的进展。“荧光已经改变了人们分析细胞并且观察细胞内部发生状况的方法。”在荧光检测技术中，Yee更喜欢共聚焦显微术和其他高通量技术。“下一步将是无标记的细胞分析，不过还有很多难题须要解决，”他补充道。

　　探查微生物

　　当Pei-WongShi10年前完成他的关于西尼罗病毒（WNV）博士论文并去耶鲁大学作博士后工作的时候，他对自己的研究工作能否在实际的公共卫生事业上得到什么应用还是一无所知的。不过后来纽约州西尼罗病毒的突然蔓延使情况发生了急剧的变化。今天，在的纽约卫生部Wadsworth中心，Shi博士正在主持一个NIH资助的科研项目，研究WNV的分子生物学和开发治疗蚊子传染的病毒性疾病的药物。

　　Shi及其合作者用CBAs探究野生型和突变的WNV是如何进攻并进入细胞。因为他们了解WNV的基因序列（它是一个RNA病毒），所以他们能顺利使用点核苷酸取代法制造人工病毒类似物。他们还把绿色荧光蛋白（GFP）或荧光素酶引进基因组，从而对感染性和毒性提供快速的光学分析方法。

　　在Shi博士看来，这是一个药物发现有效系统，他说：“因为我们只要对被感染细胞处理后所发出的光的量进行简单测量之后，我们就可以快速的筛选出表现出抗病毒活性的那些化合物。”在用实验药物对细胞进行培养之后，Shi将细胞溶解，然后查看绿色荧光蛋白或与荧光素酶活性，后者与病毒复制成正比。他们还开发出了半自动微孔板格式的分析方法。

　　致力于发现新的抗病毒药物的研究人员曾一度需要进行复杂的细胞感染分析，才能确定药物治疗能够抑止病毒复制的程度。“采用原来的技术，每天试验20种化合物就感觉很幸运了，”Shi指出，“而采用我们的方法，每星期能研究数千种化合物。”Shi的工作不仅使制药业感兴趣，而且还吸引了其他学术界，争相与之合作进行抗病毒药物的研发。

　　应用领域更广

　　CBAs的应用范围远远超出了生物学系统。肯塔基大学的SylviaDaunert教授开始将CBAs用于环境科学研究。她早期的工作涉及用含有报道分子的基因工程微生物发光指示毒性金属（砷、镍、铜等）的存在。这一思路导致了若干的发现和发明，其中*个发明是将发光细菌固定在光学纤维的顶端制成的环境生物传感器。利用该平台对关键水源（湖泊、河流）和工业区水可以进行快速实时的遥控检测。

　　Daunert的无毒大肠杆菌的坚韧性，使它能够很好的应用于包括指示纸在内的其他一系列传感器形式中。“它们是有良好耐寒性的细胞，”Daunert说“你可以将它们冻干并保持，你还可以用一种缓冲溶液使它们吸水摆脱脱水状态，可以让90%以上的细胞都能复活过来。”

　　报道分子一般是调节蛋白，在特定分析物存在下可以打开和关闭。Daunert安插上这些信号系统，用它们代替从细胞中抽吸毒素的天然防御系统蛋白。这样一来，细胞便不再驱逐毒素，而是通过发光、化学发光或荧光向外界报告事态信息。她从此将研究方向转移到利用微流体平台的生物医学细胞传感的研究领域。在一项她比喻为个人立体照片的发明中，该装置包括有一个转动的微型带槽沟的盘，在盘上固定有信号细胞和试剂。将一份水样品放到盘中的池内，水样便迅速通过盘中的槽沟并通到放有100种分析物的传感区域。这一装量原先是由美国国家航空航天局（NASA）资助研制的，现在她的科研同事正试图将其商品化。

　　现在正在进行中的一个科研项目，利用了病原细菌把类似病原体募集到感染部位去的那种化学信号。Daunert设计了细胞传感器，在信号分子存在下可以发光，因此可在胃肠感染的早期阶段就指明出来。

　　广阔的发展空间

　　越来越多对CBAs感兴趣的生物学家愿意与Chih-MingHo博士那样的工程师进行合作，Ho博士是加州大学细胞模拟空间探索（CMISE）研究所的科研主管。该研究所17名教师和约60名研究生和博士后利用微米和纳米技术扰动、检测和驱使细胞转化为所需要的表现型。例如，Ho博士的微芯片技术能以单碱基对的分辨率定量测定低丰度的RNA和DNA，CMISE其他的研究成果更让人吃惊。

　　光衍射极限约为200nm，这是显微技术长期以来未能克服的障碍：小于200nm的物体不能辨别。CMISE的科研人员ZhangXiang正在研究一种近场光学（波长比可见光短得多）能使小至60nm的物体成像。他相信，zui终会达到10nm的分辨率，相当于一个大分子的大小。“你不妨回想一下，显微镜曾为生物学做出了巨大的贡献，”Ho博士说，“而现在我们有了纳米显微镜。”CMISE另一项技术是将一台原子力显微镜（AFM）放在一个细胞上。旋转的细胞驱动原子力显微镜，产生一个振动图像，它在放大之后，通过一个扩音器可发出能听得到的声音，可用来分析各种图像。这项技术称之为声谱细胞学，可以用来分辨正常的和有病的细胞，并且能区分试验细胞和对照细胞。

　　CMISE一项zui有趣的发明出自WuMing博士之手。他用一光束和软件写一个“movie”，当和一个二维电泳力相联结时，此创作便成了一个虚似的可以放置和移动细胞的微型机器。Ho博士说道：“做一个能完成同样工作的微机要花费一个博士生5年长的时间，而我们用书写软件完成此项工作则只需要5分钟。”