细胞培养的污染来源及鉴别

一、污染来源

　　细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径：

　　1、不洁的动物组织标本

　　很多动物组织本该是无菌的（直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外），但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。

　　2、空气

　　空气中含有大量的微生物，如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。

　　3、清洗消毒

　　培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不*也会引入微生物和有毒物质。

　　4、操作

　　来自操作者的污染主要有以下几方面：

　　（1）器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末重新处理。

　　（2）操作者未戴口罩、帽子，呼出气中排出细菌和支原体。

　　（3）培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。

　　（4）操作者不当心，动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等。

　　（5）操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等。

　　5、血清

　　市售血清灭菌不*，潜在病毒和支原体污染。

　　二、污染的鉴别

　　1、细菌、真菌污染的检测

　　（1）肉眼观察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

　　（2）镜下观察在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

　　（3）接种观察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。

　　2、支原体污染的检测

　　（1）相差显微镜观察将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物（一般用长形盖玻片），24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。

　　（2）低涨处理地衣红染色观察取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配制的Carnoy液固定两次，每次10分钟，取出盖片凉干。用培养液时，先吸取1mL，500～800r/min离心5分钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分钟，加入Carnoy液固定，离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3张涂片。然后用2%醋酸依地红（地衣红2g，冰醋酸60mL，加蒸馏水至100mL）染5分钟。纯酒精过三次，每次1分钟，封入Euparal或树胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色，再封片。镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。

　　（3）荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258（生理盐水配制）中染色10分钟，置于蒸馏水漂洗1～2分钟，向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5滴pH5.5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

　　（4）电镜检测若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法（见第九章）。

　　（5）培养检测将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。细胞培养污染