酶联免疫法（ELISA）测定氯霉素CAP残留

酶联免疫法（ELISA）测定氯霉素CAP残留

（1）试剂和材料 以下所有试剂除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB／T
6682规定的二级水。
①0．2mol／L硫酸
②卜葡糖苷酸酶
③乙酸乙酯
④异辛烷
⑤三氯甲烷酶联免疫法（ELISA）测定氯霉素CAP残留
⑥乙酸钠
⑦氯霉素检测试剂盒（2—8~C冰箱中保存）
（2）仪器和设备
①酶联免疫反应读数仪
②分析天平 精度0．00001g
③天平 精度0．01g
④冷冻离心机
⑤50ml具塞离心管
⑥匀浆机酶联免疫法（ELISA）测定氯霉素CAP残留
⑦微型振荡器
⑧回旋振荡器
⑨微量移液器
⑩恒温干燥箱
（3）测定步骤
①尿样的制备 取上层用稀释剂／洗涤缓冲剂稀释5倍，备片
②肌肉组织（包括鱼和虾）中氯霉素的提取 取38组织，加入6mi的乙酸乙酯，匀浆lmin，在2000r／mln下，离心15min。取上层4mi，在70~C下蒸干。加入2mi的异辛烷：三氯甲烷（2：3）溶解剩余物，旋转lmin。加Rmi稀释剂／洗涤缓冲剂，再旋转2rain。（如果有乳化现象，把试管放在80~C的恒温室约20min，直至见到分离层）。再在2000r／min下离心10rain，取上层备用。
③肝／肾中氯霉素的提取 取3s组织，加入3ml乙酸钠缓冲剂（o．1mol几，pH 5）和8000U 9—葡糖苷酸酶，匀浆30s，置于37~C的恒温箱内2h。加12ml的乙酸乙酯，匀浆lmin，在2000r／Illin下，离心15min。取上层lml，在70~C下蒸干。加入2ml的异辛烷：三氯甲烷（2：3）溶解剩余物，旋转lmin。加lml稀释剂／洗涤缓冲剂，再旋转2min（如果有乳化现象，把试管放在80~C的恒温室约20min，直至见到分离层）。再在2000r／mln下离心10rain，取上层备用。
④测定。
室温应控制在19—25~C。
取在19～25 0C放置1—2h的试剂盒，按每个标准溶液和试样溶液至少两孔计算所需酶联板条的数量，插入框架。每个微孔加入标准溶液或试样溶液各25tzL，再在每个微孔内加入酶标二抗100t~L，封口膜封板，室温下孵育1h。
倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。加入250／uL稀释的稀释剂／洗涤缓冲剂到酶联板的微孔内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板6次。
用多道移液器加入底物125tzI。到每个微IL内，室温避光孵育20min。
用多道移液器每孔加终止液o．2mol／L硫酸100ul。
在10min内将酶联板放于酶标仪内，于450nm波长处测定吸光度值。
（4）计算 用数据分析软件对结果进行分析，绘出标准曲线，并得出试料中氯霉素的含量。
（5）灵敏度和回收率 本方法的检测限为：尿样0，25P8／L，肌肉0．1P8／k8
1．5ug／kg。
本方法在lug／kg添加浓度水平上，回收率范围为60％～120％。